如何解決免疫組化染色過(guò)程中的問(wèn)題

一、“雜音”染色片

     免疫組化除正常的真實(shí)的陽(yáng)性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說(shuō)明，筆者將其歸納為下面幾種。
    1、 全片著色
    全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
     （1）抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
    （2）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
    （3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
    （4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫(huà)圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
    （5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4ºC冰箱過(guò)夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。（6）、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。
    2、 切片邊緣著色
    切片邊緣著色也是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2 mm。用DAKO筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4 mm。
    3、“陰陽(yáng)臉”著色
    指組織一半著色一半無(wú)著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開(kāi)而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑*覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開(kāi)使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開(kāi)始試劑已全部覆蓋了組織，但后來(lái)試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對(duì)于這種問(wèn)題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。有時(shí)，用DAKO（或PAP）筆在組織周圍畫(huà)圈時(shí)，劃線太靠近或畫(huà)到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達(dá)到靠近劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽(yáng)分明的著色，只是不著色區(qū)域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破。
   4、 灶片狀著色

  切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問(wèn)題的原因有：（1）裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過(guò)深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺(tái)不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。（2）、壞死組織灶，免疫組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致終著色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。（3）、制作APES膠片時(shí)，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時(shí)、熱水沖洗玻片1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮）浸泡玻片5分鐘、玻片過(guò)一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過(guò)一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37°C過(guò)夜干燥、室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。如果制片過(guò)程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當(dāng)加入一些丙酮。

    5、 間質(zhì)著色
    著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是lambda和kappa染色時(shí)。當(dāng)甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí)，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)著色。抗體不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色，我們?cè)龅紺D20抗體不純，除了染上B細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。
    6、 細(xì)胞漿著色
    胞漿著色是所有“雜音”染色中具有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無(wú)著色，看上去與真實(shí)的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見(jiàn)于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過(guò)清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色，如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）、過(guò)氧化氫酶（肝、腎），這些可用過(guò)氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過(guò)形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色有欺騙性，因?yàn)樗鼜V泛的存在于組織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉，加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)度在不同的組織有所不同，免疫從弱陽(yáng)性（+）到強(qiáng)陽(yáng)性（+++），內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測(cè)系統(tǒng)Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干擾。
    7、 細(xì)胞核著色
    不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)、組織變干、微波修復(fù)液的pH值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過(guò)程中修復(fù)液留下得太少，未沒(méi)過(guò)組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工作。

二、 無(wú)色片
    染色結(jié)束后，切片中見(jiàn)不到任何陽(yáng)性信號(hào)。這是常規(guī)工作中比較常見(jiàn)的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：1、真陰性結(jié)果：整個(gè)染色過(guò)程沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題，組織或細(xì)胞確實(shí)不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實(shí)的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）、切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是病理醫(yī)生選擇錯(cuò)了切片或抗體選錯(cuò)了，要麼是技術(shù)員選錯(cuò)了蠟塊。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術(shù)員的事，病理醫(yī)生也起著*的作用。（2）、染色過(guò)程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問(wèn)題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)才能檢測(cè)抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個(gè)逐漸的過(guò)程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長(zhǎng)期不用和/或已超過(guò)有效期是主要的原因。也可見(jiàn)于染色過(guò)程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時(shí)少了過(guò)氧化氫。為了避免這種簡(jiǎn)單的錯(cuò)誤，有一種簡(jiǎn)單的方法：在三抗孵育結(jié)束時(shí)，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過(guò)程沒(méi)有錯(cuò)誤。如果這種DAB再滴到切片上沒(méi)有出現(xiàn)任何陽(yáng)性信號(hào)，問(wèn)題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問(wèn)題肯定在三抗DAB或DAB的配制過(guò)程。這種簡(jiǎn)單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問(wèn)題可能的原因。
    解決陰性染色的問(wèn)題非常簡(jiǎn)單，就是設(shè)立“陽(yáng)性對(duì)照”。如果陽(yáng)性對(duì)照有了表達(dá)，說(shuō)明染色的全過(guò)程和所有試劑都沒(méi)有問(wèn)題。如果此時(shí)測(cè)試片仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說(shuō)明組織或細(xì)胞沒(méi)有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有著色，表明染色過(guò)程中某個(gè)或某些步驟出了問(wèn)題或試劑出了問(wèn)題。應(yīng)一一尋找原因。陽(yáng)性對(duì)照包括兩種，一種稱為“自身對(duì)照”或“內(nèi)部對(duì)照”，這是指在測(cè)試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在T和B細(xì)胞抗原，CD20或CD3都應(yīng)該有表達(dá)。自身對(duì)照是一種比較理想的對(duì)照，對(duì)照和測(cè)試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗(yàn)條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對(duì)照片時(shí)選擇既變組織同時(shí)又有正常組織的部分，這樣有利于對(duì)比。另一種稱為“外部對(duì)照”，有時(shí)在測(cè)試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來(lái)檢測(cè)，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，尚能提示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無(wú)法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問(wèn)題。因此，應(yīng)另外設(shè)立一個(gè)已知的陽(yáng)性對(duì)照。這種在測(cè)試組織之外的陽(yáng)性對(duì)照稱為“外部對(duì)照”。在實(shí)際工作中需要設(shè)立外部對(duì)照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽(yáng)性對(duì)照，工作量會(huì)很大。為了解決這個(gè)問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續(xù)切片儲(chǔ)備待用，需要時(shí)取出一張便可作為陽(yáng)性對(duì)照。另外，比較簡(jiǎn)單的方法，是采用闌尾作為陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)榕c人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測(cè)大多數(shù)常用的抗體。
    設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照是病理醫(yī)生的任務(wù)或責(zé)任，而不是技術(shù)員的責(zé)任。病理醫(yī)生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對(duì)照，如果沒(méi)有，就應(yīng)告訴技術(shù)員采用陽(yáng)性對(duì)照。因此，病理醫(yī)生在免疫組化中的作用是不可忽視的。
抗體未覆蓋上測(cè)試組織：當(dāng)多塊散開(kāi)的小組織染色時(shí)，可能漏掉某塊組織染色。