利用Ion半導(dǎo)體測序開展基因表達(dá)譜分析

             研究顯示雜交芯片可產(chǎn)生大約兩百萬個已定位的讀取[7]，但也有研究證實(shí)，即使讀取數(shù)目過億，提高讀取數(shù)目仍然繼續(xù)增加其信息量 那么，究竟Ion PGM™測序儀生成多少個100 base讀取能相當(dāng)于一個基因表達(dá)微陣列芯片呢？在白皮書[9]中我們對Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays （HG-U133 Plus 2.0）的芯片質(zhì)量控制（MAQC）的微陣列數(shù)據(jù)與Ion PGM™系統(tǒng)生成的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。圖1顯示了Ion PGM™測序儀數(shù)據(jù)按照不同檢測閾值下所得的基因數(shù)和微陣列芯片所能檢測到的基因數(shù)。當(dāng)采用zui嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測閾值即每個基因≥10讀取時，兩百萬個來自Ion PGM™測序儀的已定位讀取所能檢測到的基因數(shù)超過了微陣列芯片能檢測的基因。

             當(dāng)讀取計(jì)數(shù)閾值放寬到≥5讀段數(shù)/基因時，僅僅1百萬個Ion RNA-Seq已定位讀取所能檢測到的基因數(shù)就超過了芯片的基因檢測數(shù)。利用來自Ion PGM™測序儀的2百萬個平均讀取所能檢測到的顯著差異表達(dá)基因數(shù)（sig DEGs）要多于微陣列芯片所能檢測到的sig DEGs數(shù)。在p ≤0.05和倍數(shù)變化f≥2標(biāo)準(zhǔn)下，在HBRR和UHRR樣本中Ion PGM™測序儀得到的sig DEGs數(shù)為4,630，而相比之下芯片得到的sig DEGs數(shù)為4,198將Ion PGM™測序儀生成的兩百萬個已定位讀取所產(chǎn)生的基因差異表達(dá)結(jié)果與qPCR結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)qPCR 和RNA-Seq得到的sigDEGs倍數(shù)變化的對數(shù)值的Pearson相關(guān)系數(shù)（R）超過0.95。

             在Ion PGM™平臺進(jìn)行RNA-Seq實(shí)驗(yàn)的另一個優(yōu)勢在于，能夠應(yīng)用ERCC RNA Spike-In Mix對轉(zhuǎn)錄本檢測靈敏度進(jìn)行評估。這些ERCC轉(zhuǎn)錄本混合物是一些含多聚腺苷酸化且無標(biāo)記的RNA，該混合物經(jīng)過美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST）鑒定，是評估RNA測量系統(tǒng)性能的工具，能控制實(shí)驗(yàn)可變因素。這些ERCC轉(zhuǎn)錄本的GC含量經(jīng)過平衡，更貼近真核生物內(nèi)源性mRNA的特征，它們的長度范圍在250 到2,000個核苷酸之間。ERCC轉(zhuǎn)錄本混合物的含量構(gòu)成經(jīng)特殊設(shè)計(jì)，能代表一個大動態(tài)范圍的表達(dá)水平。ERCC ExFold RNA Spike-In Mix可用于評估基因差異表達(dá)的檢測靈敏度。這些質(zhì)控RNA使用戶得以直接評估文庫質(zhì)量、檢測靈敏度、動態(tài)范圍以及表達(dá)倍數(shù)變化。劑量響應(yīng)散點(diǎn)圖顯示，ERCC相對濃度的對數(shù)值與已定位讀取數(shù)的對數(shù)值呈線性關(guān)系（圖2）。利用這些外部RNA質(zhì)控有助于將來自合作實(shí)驗(yàn)室所產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行直接比較。